重组蛋白的详细构建方法
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- 发布时间：2021-12-30 10:14
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用重组DNA表达目的基因得到的蛋白质变成重组蛋白，在生物信号传递、药物研发和科学研究过程中发挥重要作用。先介绍一下重组蛋白的制作过程。
重组蛋白的详细构建方法
用重组DNA表达目的基因得到的蛋白质变成重组蛋白，在生物信号传递、药物研发和科学研究过程中发挥重要作用。先介绍一下重组蛋白的制作过程。
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用重组DNA表达目的基因得到的蛋白质变成重组蛋白，在生物信号传递、药物研发和科学研究过程中发挥重要作用。先介绍一下重组蛋白的制作过程。
1.基因扩增
(1)引物合成
搜索目的蛋白的基因信息，结合蛋白的结构信息，选择片段或全长设计引物。注意尽量避开引物得分高的跨膜区和复杂的二级结构，一般是N端或C端，利用载体等信息，核酸序列的限制性位点。相关部门根据经验提出修改建议后，定稿提交给第三方公司进行引物合成。
(2)基因克隆机的重组鉴定
1)PCR
根据蛋白的特异表达组织，选择特异的组织RNA用上述引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量选择目标片段进行凝胶切割和回收。再次进行PCR扩增，获得大量DNA，并回收PCR产物。
2)酶切和连接
根据酶切位点，将目的PCR产物和相应的载体进行酶切，得到粘性端的DNA产物，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据目的条带大小选择相应的片段进行凝胶切割回收。以及将具有相同限制性位点的载体与DNA的片段连接。
3)转化、挑菌、验证
将连接的靶片段转化到感受态大肠杆菌中，并在LB平板上培养过夜。挑取平板上的斑块进行验证聚合酶链反应，并将聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。根据目的条带的大小，选择相应的菌液进行测序，测序正确后保存种子。
2.蛋白质表达
(1)蛋白质表达试验
选择少量菌株进行培养，诱导表达，对表达的蛋白进行SDS-PAGE，根据目的条带的大小判断目的蛋白是否表达，表达成功后进行蛋白预扩增实验。
(2)蛋白质扩增实验
将小试成功表达的蛋白菌株在400-800 ml培养基中培养表达，进行SDS-PAGE。根据靶带的大小判断靶蛋白是否成功表达。预扩增实验成功后，进行进一步的蛋白质扩增实验。扩增实验在800-1600 ml培养基中培养，具体验证同上。
3.蛋白质纯化
因为载体上有他的标签，所以用镍柱纯化。部分蛋白质可能形成包涵体，纯化后的蛋白质将经过SDS-PAGE、BCA等分子量和纯度实验验证，纯度在95%以上。
4.质量检查
获得蛋白质后，将其冷冻干燥。冷冻干燥后，将通过常规蛋白质实验进行验证，通过测试后储存。
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