蛋白质纯化的主要方法及注意事项
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- 发布时间：2022-04-14 13:34
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蛋白质纯化的主要方法：根据分子大小不同的分离方法:透析和超滤(利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质);梯度离心(蛋白质在介质中离心时，质量和密度较高的颗粒沉降较快);凝胶过滤(一种柱色谱法)。
蛋白质纯化的主要方法及注意事项
蛋白质纯化的主要方法：根据分子大小不同的分离方法:透析和超滤(利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质);梯度离心(蛋白质在介质中离心时，质量和密度较高的颗粒沉降较快);凝胶过滤(一种柱色谱法)。
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蛋白质纯化的主要方法
(1)根据分子大小不同的分离方法:透析和超滤(利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质);梯度离心(蛋白质在介质中离心时，质量和密度较高的颗粒沉降较快);凝胶过滤(一种柱色谱法)。
(2)溶解度差异分离:等电点沉淀法(由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间的静电斥力，容易聚集沉淀，此时溶解度低);盐析和盐析(利用一定浓度的盐溶液来增加或减少蛋白质的溶解度)。
(3)根据电荷的不同分离方法，主要包括电泳和离子交换色谱法;
(4)蛋白质的选择性吸附分离(利用颗粒吸附力的差异达到分离的目的)。
(5)根据配体的特性进行分离——亲和层析(利用蛋白质分子能与另一种称为配体的分子特异性结合但不能共价结合的生物学特性)。
(6)低温有机溶剂沉淀法:使用与水混溶的有机溶剂，甲醇、乙醇，可以降低大部分蛋白质的溶解度，使其沉淀。这种方法比盐析分辨率高，但蛋白质易挥发，要在低温下进行。
蛋白质纯化注意事项
进行任何一种蛋白质纯化时，都要时刻注意保持其稳定性，保护其活性。需要记住一些一般预防措施，包括:
1.操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。
2.不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。
3.适当的pH，除非进行聚焦层析，否则所用缓冲溶液的pH应与pI相同，以防止蛋白质沉淀。
4.使用蛋白酶抑制剂防止蛋白酶降解目标蛋白;在细胞内纯化蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA污染蛋白质。
5.避免反复冷冻和搅拌样品，以防止蛋白质变性。
6.缓冲溶液的组成尽可能模拟细胞内环境。
7.在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或β-巯基乙醇)以防止蛋白质氧化。
8.加入1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目的蛋白的损伤。
9.使用灭菌溶液防止微生物生长。
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